CRISPR/Cas9基因编辑技术在生物医学研究中引发了革命性的变革。通过对基因的敲除、敲入以及转录激活或抑制，相关技术已广泛应用于诸多领域，包括研究细胞和动物模型中的基因功能，改良农作物的基因，以及开发针对人类致病基因的基因疗法等。CRISPR基因编辑的组成部分可以通过多种方法递送到靶细胞，包括病毒和非病毒方式。本文将重点比较不同非病毒基因递送系统的特点，并阐述其在各种实验中的关键应用要点。

质粒DNA递送系统

质粒DNA递送系统是引入外源遗传物质最简单且成本最低的方法，通常采用直接转染质粒DNA（pDNA）。一个质粒载体能够携带Cas9核酸酶和gRNA的编码序列，或是使用两个质粒载体分别携带这两种成分。质粒递送的优势在于DNA的稳定性，使其能够实现较长时间且稳定的转基因表达，特别是在靶点位于高度压缩的高级染色质结构时，较慢且持续的CRISPR组分表达有助于确保基因编辑机器能够有效到达靶位点。

然而，持续的Cas9表达可能导致非靶位点的切割，增加脱靶效应的风险。此外，质粒DNA在整合到宿主基因组中时，还有可能引发插入突变。为了降低脱靶效应，可以考虑在Cas9上引入额外的修饰，如降解信号序列或抑制结构域，或使用诱导表达系统表达CRISPR组分。

诱导表达系统常用的为四环素响应元件（TRE）启动子，当存在四环素或其类似物时可激活该系统。对于需要在同一细胞类型中进行多次编辑的实验，建议使用带有四环素诱导的Cas9表达细胞稳转株，以最小化背景编辑并实现长期和高效的基因编辑效果。尽管质粒的制造相对简单且易于扩大规模，但在制备过程中存在内毒素污染的风险，以及某些为细菌扩增而设计的序列可能引发的宿主免疫反应。为此，使用微环质粒DNA骨架（如miniVec®）可能是一个有效的解决方案。

RNA递送系统

将CRISPR组分以RNA（Cas9 mRNA和gRNA）的形式递送是一种比质粒更高效的方法，它绕过了转录过程并可立即在细胞质中启动Cas9的翻译。这种方式特别适合短期实验，因为RNA的不稳定性使其在宿主体内迅速降解，因此CRISPR组分的表达时间相对较短。这种特性有助于降低长期的脱靶效应风险，通常被认为比质粒DNA递送更为安全。由于mRNA可以在体外以无细胞方式生产，从而减少了污染风险，但其生产成本较高且技术更为复杂。

RNA同样可以通过显微注射、电穿孔或LNP传递至细胞中。基于LNP的递送已被证明是有效的方法，如辉瑞和莫德纳的COVID-19疫苗都采用了这一策略。未来，使用mRNA LNP的CRISPR疗法将在针对甲状腺素淀粉样变性（ATTR）的一期临床试验中进一步展现其潜力。然而，与目前获批的体外基因编辑疗法相比，这种体内基因编辑的方法在时间和人力成本上相对高昂。

核糖核蛋白复合体（RNP）递送系统

递送CRISPR组分的效率最高的非病毒方法是核糖核蛋白复合体（RNP）。由于RNP无需转录和翻译，Cas9蛋白和gRNA能够迅速进入细胞核并启动基因编辑。与RNA一样，这种方法没有外源基因整合主基因组的风险，其CRISPR组分表达是短暂的，有助于降低脱靶效应。然而，RNP较易被蛋白酶降解，这使其在稳定性上不如质粒和mRNA，对使用和存储的环境要求较高，特别是在临床应用中。

电穿孔被认为是将RNP有效送入细胞的方法，并在体外基因编辑和小鼠胚胎基因工程中取得了成功。此外，通过LNP静脉注射RNP也已被证明对靶向递送至肌肉、大脑、肺和肝脏同样有效。目前，基于RNP的CRISPR疗法已在临床中获得成功——首个基于CRISPR的药物Casgevy获得FDA批准用于治疗镰状细胞贫血，该药物采用电穿孔方式将RNP形式的CRISPR组分转入患者细胞，随后对这些细胞进行筛选并回输给患者。

在探索生物医学领域的先进技术时，尊龙凯时所代表的创新和突破将引领未来的基因编辑研究，为疾病治疗提供新的希望。